Исследование морфологии нейтрофилов крови человека в состоянии фагоцитоза методом сканирующей зондовой микроскопии

Участники проекта: Заславская М.И., к.б.н., ассистент кафедры микробиологии НГМА
Гущина Ю.Ю., н. с. НОЦ ФТНС ННГУ
Плескова С.Н., к.б.н., н.с. каф. микробиологии НГМА
Кокшаров И.А., н.с. ЦНИЛ НГМА
Ерастова Ю.Г., студентка 6 курса НГМА

Мы исследовали процесс фагоцитоза нейтрофилов крови человека: формирование превдоподий нейтрофилов в присутствии микроорганизмов исследовали методом СЗМ, данные о кислородной активности фагоцитирующих клеток получали по результатам хемилюминесценции. В результате исследований выяснили разную что процессы формирования псевдоподий и формирование радикалов О2 имеют разную динамику.

Полиморфноядерные лейкоциты (ПМЛ) играют важную роль в иммунной системе организма. Доставляемые кровью в очаг острого воспаления, нейтрофилы поглощают микробы. Активацию нейтрофилов в воспалительном процессе можно разделить на несколько этапов: хемотаксис, адгезия и фагоцитоз. Как известно, эти функции независимы друг от друга. Процесс фагоцитоза начинается с формирования псевдоподий, окружающих микроорганизмы. Затем следует процесс образования фагосомы и ее слияние с лизосомой. Образование фаголизосомы, сопровождается выделением лизосомальных ферментов и образованием активных форм кислорода, обеспечивающих деструкцию поглощенного объекта. Процесс сопровождается затратой большого количества кислорода и обозначается как респираторный взрыв. В этой работе мы попытались установить связь между процессами формирования псевдоподий и кислородной активностью нейтрофилов.

Подготовка образцов для исследований. Полиморфноядерныелейкоциты (ПМЯЛ) человека были выделены из венозной крови здоровых доноров путем центрифугирования через двойной градиент фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden). Использовались концентрации градиента 1.077 и 1.116 г/мл. Эритроциты лизировали добавлением холодного изотонического раствора NH4CL (155 mM NH4CL, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2-7.4) в течение 12 мин. Затем гранулоциты отмывали забуференным физиологическим раствором и ресуспендировали в буфере.

Микроорганизмы Staphylococcus aureus 7M и Candida albicans 601 использовали в концентрации 2.108 клеток/мл и 9.106 клеток/мл соответственно.

ПМЯЛ (0.2 мл) инкубировали с суспензией микроорганизмов (0.2 мл) в опыте или с забуференным физиологическим раствором в контроле в течение 5, 10, 15, 20, 30 мин (37oC) в се6ликонированных центрифужных пробирках, затем отмывали (1000g, 2 мин).

Затем 0.05 мл наносили на поверхность стекла. После экспозиции (40 min, 20oC) клетки фиксировали метанолом (0.05 ml, 10 min). Приготовленные препараты отмывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе.

Методы исследований. Топография поверхности ПМЛ исследовалась на зондовом микроскопе TopoMetrix Accurex (USA) в контактном режиме. Использовались фирменные зонды из Si3N4 с жесткостью 0,036 N/m. Радиус закругления кончика зонда составлял примерно 50 nm. Данные о кислородной активности ПМЯЛ получали, изучая хемилюминесцентную активность на жидкостно-стинциляционном счетчике "Beta-1" (Медаппаратура, Украина).

Суспензию ПМЯЛ (0.5 x 106клеток/мл), обрабатывали люминолом (Serwa, USA) в конечной концентрации 10-5 M и смешивали с суспензией микроорганизмов (106 клеток/мл) в опыте или забуференным физиологическим раствором в контроле в конечной концентрации 1 мл. Кинетика люминолзависимой хемилюминесценции измерялась в течение 120 мин.

Результаты исследований. Фиксированные интактные нейтрофилы имели сферическую форму (Рис.1).

Рис.1. Топография поверхности интактного нейтрофила.

После инкубации нейтрофилов с микроорганизмами S. aureus и C. аlbicans происходило формирование псевдоподий. Исследования методом СЗМ показало полиморфизм поверхности нейтрофилов вследствие образования разных форм псевдоподий в одинаковых условиях. (Рис. 2, 3, 5).

Рис. 2. Топография поверхности нейтрофила через 5 минут, после инкубации S.аureus.

В результате исследований установлено, что наиболее активное формирование псевдоподий происходит через 5-10 минут после инкубации (Рис.2-5) и заканчивается на 20-30 минуте (Рис.5).

Рис. 3а. Топография поверхности нейтрофила через 5 минут, после инкубации со S.аureus.

Рис. 3б. Структура псевдоподий. Хорошо видны стафилококки, среди псевдоподий.

Установлено, активность нейтрофилов не зависит от того, какие микроорганизмы поглощаются (рис. 2 и рис. 4).

Рис.4. Топография поверхности нейтрофила через 5 минут, после инкубации С.albicans.

Данные хемилюминесценции показывают возрастание уровня дыхательной активности после стимуляции нейтрофилов. Пик респираторного взрыва приходился на 70-90 минуту.

Рис.5. Топография поверхности нейтрофила через 20 минут, после инкубации с С.albicans.

Выводы. Оба процесса: и формирования свободных радикалов О2 и образование псевдоподий – катаболические процессы, зависящие от АТФ. Скорее всего, в течение респираторного взрыва энергетические ресурсы нейтрофила интенсивно перераспределяются в сторону гексозомонофосфатного шунта (для продукции свободных радикалов кислорода), а не в сторону гликолиза (для продукции АТФ, которая необходима для активности цитоскелета). Поэтому вероятно, что увеличение продукции свободных кислородных радикалов это фактор, который может ограничивать способность ПМЯЛ формировать псевдоподии in vitro и необходимо для более эффективного внутриклеточного разрушения микроорганизма.

В результате исследований показано, что две стадии фагоцитоза – формирование псевдоподий, захват чужеродных тел, втягивание внутрь мембраны и формирование свободных радикалов О2, непосредственно связанное с разрушением микроорганизмов процессы не связанные между собой.

Наши исследования доказывают описанный ранее феномен функциональной дискретности нейтрофилов.

Результаты опубликованы в журнале Physics of Low-Dimensional Structures:

S.N. Pleskova, M.I. Zaslavzkaja, Yu.Yu Guschina, I.A. Koksharov, Yu.G. Erastova. Morfological investigation of human blood neutrophil phagocytosys in vitro by AFM. Phys.Low-Dim.Struct., 3/4 (2001): pp.229-236.